ردیابی همزمان چند ویروس مهم در گیاهان آلوده سیب زمینی با استفاده از روش multiplex rt-pcr و مقایسه آن با آزمون سرولوژیکی اِلایزا

ویروس های y (pvy)، x (pvx)، s(pvs) و پیچیدگی برگ سیب زمینی (plrv) از مهم ترین ویروس های بیمارگر سیب زمینی به شمار می روند و به طور جدی باعث کاهش میزان و کیفیت محصول سیب زمینی می شوند. این ویروس ها از تمام مناطق مهم کشت سیب زمینی ایران گزارش شده اند. آلودگی به ویروس های یاد شده در سیب زمینی به جز ویروس y و پیچیدگی برگ سیب زمینی معمولاً بدون علایم باقی می ماند. از این رو گیاهان سیب زمینی مزارع تولید غده بذری از لحاظ عاری بودن از ویروس های یاد شده و صدور گواهی سلامت بذر باید به طور منظم بررسی شوند. تا به حال آزمون اِلایزا به طور وسیعی برای ردیابی ویروس های یاد شده مورد استفاده قرار گرفته است، اما اغلب به دلیل غلظت پایین ویروس و وجود ترکیبات بازدارنده در عصاره گیاهان ردیابی ویروس ها به خوبی انجام نمی گیرد. بنابراین معرفی یک روش دقیق، حساس، کارآمد، قابل اعتماد، ارزان و سریع برای ردیابی همزمان ویروس های سیب زمینی ضروری است. در این تحقیق، روش multiplex rt-pcr برای ردیابی همزمان ویروس های y، x، s، پیچیدگی برگ سیب زمینی و کنترل داخلی استفاده شد. این روش با آزمون سرولوژیکی اِلایزا که روشی رایج برای ردیابی ویروس های سیب زمینی است، مقایسه شد. به همین منظور، rna کل از برگ گیاهان سیب زمینی آلوده به ویروس با استفاده از بافر rnx-plus استخراج شد. سپس dna مکمل برای ویروس های فوق و ژن 18s rrna با استفاده از آغازگر اختصاصی معکوس به صورت جداگانه ساخته شد و واکنش uniplex rt-pcr برای هر کدام از ویروس ها انجام گرفت. برای بهینه سازی واکنش multiplex rt-pcr، rna کل از مخلوط وزن های مساوی از بافت دو گیاه که هر کدام به دو ویروس آلوده بودند (pvy, pvx, pvs, plrv) استخراج گردید. سپس، واکنش multiplex rt-pcr با استفاده از پنج جفت آغازگر در یک واکنش انجام گرفت. در نهایت، پنج قطعه متفاوت (145-342 جفت باز) که اختصاصی ویروس ها و کنترل داخلی بودند به طور همزمان تکثیر شد و بر اساس وزن مولکولی آنها تشخیص داده شدند. نتایج نشان داد multiplex rt-pcr روشی مناسب در تشخیص گیاهان آلوده سیب زمینی به ویروس های y، x، s و پیچیدگی برگ سیب زمینی است. حساسیت روش بهینه سازی شده multiplex rt-pcr با روش تجاری das-elisa در ردیابی ویروس های y، x، s و پیچیدگی برگ سیب زمینی مقایسه شد. عصاره گیاه و rna کل از بافت گیاهی آلوده استخراج شد و رقت های یک دهم آن به صورت پشت سر هم آماده شد و در هر دو روش multiplex rt-pcr و اِلایزا برای ردیابی ویروس ها به کار رفت. نتایج نشان داد که حساسیت multiplex rt-pcr صد برابر بیشتر از آزمون اِلایزا در ردیابی ویروس های y، x، s و پیچیدگی برگ سیب زمینی می باشد و حساسیت duplex rt-pcr ده هزار برابر بیشتر از آزمون اِلایزا در ردیابی ویروس y سیب زمینی است. به علاوه اِلایزا اغلب به دلیل غلظت پایین ویروس و اثر بازدارندگی ترکیبات فنولی و پلی ساکاریدی موجود در عصاره گیاهان در ردیابی ویروس ها به خوبی عمل نمی کند. همچنین در اِلایزا امکان اعمال کنترل داخلی برای پرهیز از نتایج منفی کاذب وجود ندارد. در نتیجه روش مولکولی multiplex rt-pcr، روشی حساس تر، مناسب تر، اختصاصی تر، ارزان تر و سریع تر از اِلایزا در ردیابی همزمان ویروس های یاد شده می باشد. برای ردیابی همزمان چند ویروس در مزارع سیب زمینی که با هدف تولید غده های بذری کشت شده اند، بسیار موثر است.